viennalab CYP2C19說明書

CYP2C19基因的變異會導致體內(nèi)藥物或藥物代謝物的濃度過高，從而可能導致毒性，藥物不良反應的風險或藥物功效受損。的PGX-CYP2C19 StripAssay ^® 檢測導致減少或增加的細胞色素P450同工酶的CYP2C19活性的遺傳變體。

PGX-CYP2C19StripAssay®

• 攜帶CYP2C19變體的患者可能需要調(diào)整被該酶代謝的藥物的劑量。
• CYP2C19功能喪失的等位基因（* 2-* 8）與接受氯吡格雷的患者復發(fā)性心血管事件發(fā)生率較高相關(guān)，但與接受質(zhì)子泵抑制劑的患者應答性改善相關(guān)。
• CYP2C19 * 17功能獲得的等位基因可能會導致藥物治療失敗，例如在質(zhì)子泵抑制劑或抗抑郁藥治療中失敗。

產(chǎn)品詳情

PGX-CYP2C19StripAssay®

4-750

1. Lysis Solution 50 ml

2. GENXTRACT Resin 5 ml

Resuspend each time immediately before removing an aliquot.

3. Amplification Mix (yellow cap) 500 µl

4. Taq Dilution Buffer (transparent cap) 500 µl

5. DNAT (blue cap) 1.5 ml R 36/38

6. Typing Trays 3

7. Teststrips 20

8. Hybridization Buffer (white cap) 25 ml

9. Wash Solution A (white cap) 80 ml

10. Conjugate Solution 25 ml

11. Wash Solution B 80 ml

12. Color Developer 25 ml

使用說明

一、預期用途

基于聚合酶的細胞色素（cyp）2c19基因突變檢測

鏈式反應和反向雜交。

二。方法

這個過程包括三個步驟：（1）DNA分離，（2）生物素化PCR擴增

引物，（3）擴增產(chǎn)物與含有等位基因特異性的試紙條雜交

寡核苷酸探針固定成平行線陣列（圖1）。結(jié)合生物素

用鏈霉親和素堿性磷酸酶和彩色底物檢測序列。

該方法包括8個多態(tài)位點：c.681g>a（2c19*2），c.636g>a（2c19*3），c.1a>g。

（2c19*4），c.1297c>t（2c19*5），c.395g>a（2c19*6），c.819+2t>a（2c19*7），c.358t>c

（2C19*8），C.-806C>T（2C19*17）。

更多的遺傳信息可在OMIM在線孟德爾人類遺傳：

www.ncbi.nlm.nih.gov/omim

三、套件組件

見一頁所有組件清單。

脫氧核糖核酸含1.6%*（r 36/38）。

放大混合物，TAQ稀釋緩沖液，共軛溶液，洗滌液B含0.05%

奶奶3。結(jié)合液中含有鏈霉親和素堿性磷酸酶。彩色顯影劑

含有硝基藍四唑（NBT）和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）。

不使用時，將所有試劑儲存在2-8°C！

四、需要但未提供的材料

除了標準分子生物學實驗室設(shè)備外，還需要以下設(shè)備：

•可調(diào)微型離心機，轉(zhuǎn)速3000-12000轉(zhuǎn)/分（1000-12000 x g）

•培養(yǎng)箱（例如加熱塊、水浴），溫度分別為56°C和98°C（±2°C）

•熱循環(huán)器和合適的薄壁塑料反應管/帶

•TAQ DNA聚合酶

•帶振動臺和可調(diào)溫度的水浴槽（45°C±0.5°C）

•真空抽吸裝置

•振動篩（搖桿或軌道振動篩）

•可選：瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備（用于擴增產(chǎn)物的控制）

分析程序

一。DNA分離

新鮮或冷凍的血液中加入edta或檸檬酸抗凝劑；避免血液中含有肝素。

在室溫下儲存血液的時間不得超過3天，在2-8°C下儲存血液的時間不得超過1周

使用前。冷凍一年以上，或經(jīng)歷多次

三次以上的凍融循環(huán)不適合用于此程序。

把血樣帶到室溫。小心倒置采血管，充分混合

好幾次。每次取血前重復混合。

使裂解液和genxtract樹脂達到室溫。

•用帶螺帽的1.5毫升微管吸取100微升血液樣本。

•加入1毫升裂解液，合上試管，倒置數(shù)次混合。

•室溫下靜置15分鐘。

•在微型離心機中以3000轉(zhuǎn)/分（約1000 x g）離心5分鐘。

•取下并丟棄上層（頂部）1毫升上清液。

•加入1毫升裂解液，合上試管，倒置數(shù)次混合。

•在微型離心機中以12000轉(zhuǎn)/分（約12000 x g）離心5分鐘。

•除去并丟棄上清液，但約50微升可見的軟顆粒除外。

•*旋轉(zhuǎn)瓶子，重新使用Genxtract樹脂。

•向顆粒中添加200微升Genxtract樹脂。關(guān)閉管和渦流10秒。

樹脂沉積迅速。每次立即重復再懸浮

在移除另一個等份之前。

•在56°C下孵育20分鐘，渦流10秒。

•在98°C下孵育10分鐘，渦流10秒。

•在微型離心機中以12000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘。冰上涼快。

所得到的上清液含有適于在pcr中立即使用的dna模板。為了

進一步儲存時，上清液應轉(zhuǎn)移到新鮮的試管中并保持冷藏。

（2-8°C；多一周）或冷凍在-20°C。

2.體外擴增（PCR）

將所有PCR試劑和DNA模板冷藏。執(zhí)行所有步驟直到開始

冰上熱循環(huán)程序（0-4°C）。

•在TAQ稀釋緩沖液中制備新的TAQ DNA聚合酶工作稀釋液（0.2 U/微升）

（透明蓋）。

•為每個待放大的樣品準備一個反應管。把管子放在冰上。

•對于每個樣品，在冰上制備終PCR反應混合物：

15微升放大混合物（黃蓋）

5微升稀釋TAQ DNA聚合酶（1U）

5微升DNA模板

如果使用的DNA模板不是由試劑盒分離協(xié)議（第V/1章）制備的，則

建議濃度范圍為5-40微克/毫升（=每個反應25-200納克DNA）。

把管子蓋緊。將熱循環(huán)器預熱至94°C。

•插入反應管并運行以下熱循環(huán)程序：

預PCR:94°C/2分鐘。

熱循環(huán)：94°C/15秒。-58攝氏度/30秒。-72攝氏度/30秒。（35個循環(huán)）

終延伸：72°C/3分鐘。

將放大產(chǎn)品存放在冰上或2-8°C下，以備進一步使用。

可選：用凝膠電泳分析擴增產(chǎn)物（如3%瓊脂糖凝膠）。

片段長度：288254218182161146bp

三。雜交（45°C；振蕩水浴）

將水盆的水位調(diào)整到打字托盤高度的約1/2。

將水浴加熱至45°C（±0.5°C）。用校準過的

溫度計。

預熱雜交緩沖液并將溶液A洗滌至45℃（注意所有沉淀

在2-8°C下形成，*溶解。）

使試紙、DNAT、共軛溶液、洗滌溶液B和顯色劑達到

室溫。準備打字托盤。

使用干凈的鑷子為每個樣品取下一個測試條。（用手套觸摸測試條

只有！）用鉛筆在標記線外標記測試條。（沒有圓珠筆，馬克筆，

等）

•將10微升DNAT（藍帽）吸管插入每個通道的下角，用于打字

托盤（每個樣品一條通道）。

•將10微升擴增產(chǎn)物加入相應的DNA滴中。

用吸管*混合。（解決方案將保持藍色。）

•室溫下靜置5分鐘。

•在每個通道中加入1毫升雜交緩沖液（預熱至45°C）。

輕輕攪動托盤。（藍色將消失。）

•插入帶有標記的測試條（可見線條！）進入各自的車道。潛入

*。

•在水浴的搖床上，在45°C下培養(yǎng)30分鐘。

設(shè)置適當?shù)恼饎宇l率（約50轉(zhuǎn)/分）以避免溢出。保持

水盆關(guān)閉以避免溫度變化。

•孵化結(jié)束時，通過真空抽吸去除雜交溶液。

立即進行。在整個過程中，不要讓測試條干運行。

四。嚴格清洗（45°C；搖晃水浴）

•加入1毫升洗滌液A（預熱至45°C）。短暫沖洗（10秒）。

通過真空抽吸除去液體。

•加入1毫升洗滌液A（45°C）。

•在45°C的搖動水浴中培養(yǎng)15分鐘。

通過真空抽吸除去液體。

•加入1毫升洗滌液A（45°C）。

•在45°C的搖動水浴中培養(yǎng)15分鐘。

通過真空抽吸除去液體。

5個。顯色（室溫）

•加入1毫升共軛溶液。

•室溫下在搖床或軌道振動篩上培養(yǎng)15分鐘。

通過真空抽吸除去液體。

•加入1毫升洗滌液B。短暫沖洗（10秒）。

通過真空抽吸除去液體。

•加入1毫升洗滌液B。

•室溫下在搖床或軌道振動篩上培養(yǎng)5分鐘。

通過真空抽吸除去液體。

•加入1毫升洗滌液B。

•室溫下在搖床或軌道振動篩上培養(yǎng)5分鐘。

通過真空抽吸除去液體。

•加入1毫升顯色劑。

•在室溫下，在搖床或軌道振動篩上黑暗中培養(yǎng)15分鐘。

陽性反應出現(xiàn)紫色染色。

•用蒸餾水清洗測試條數(shù)次。

在暗處用吸水紙把紙條晾干。

顏色顯影后，不要將試紙置于強光下。

六、結(jié)果解釋

樣本的基因型是用所附的collectorTM表確定的。

將處理過的測試條放入字段之一，將其與示意圖對齊

使用紅色標記線（頂部）和綠色標記線（底部）繪制，并用

膠帶。

上面控制線的正反應表示共軛的正確函數(shù)

溶液和顯色劑。這條線應該總是染色陽性。

對于每個多態(tài)性位置，應獲得以下染色模式之一：

注意：陽性線的染色強度可能不同。這對結(jié)果沒有意義。